Services de laboratoire

La culture cellulaire fait référence aux méthodes de laboratoire permettant la croissance in vitro de cellules dans des conditions contrôlées de température et de nutriments. Les cellules cultivées représentent un outil très polyvalent lorsqu'il s'agit d'enquêter sur des questions de recherche scientifique fondamentale et de traduction. Considérées comme d'excellents systèmes modèles pour étudier la physiologie, la biochimie et la génétique cellulaires, les cultures cellulaires jouent également un rôle clé dans la production de vaccins viraux, le développement de nouveaux médicaments et les tests de toxicité.

Les cultures primaires sont des cellules fraîchement isolées d'un tissu, et conservées in vitro dans des conditions optimisées. Lorsqu'elles sont cultivées, ces cellules sont capables d'effectuer un nombre fini de divisions cellulaires, puis de subir une sénescence et d'arrêter de se diviser. Étant donné qu'elles dérivent directement du tissu du donneur, les cellules primaires imitent étroitement l'état physiologique des cellules in vivo et conservent les principales caractéristiques physiologiques du tissu source. C'est pourquoi ils sont considérés comme un puissant outil in vitro pour l'étude de maladies spécifiques.

Nous effectuons l'isolement de différents types de cellules - cellules épithéliales, fibroblastes, kératinocytes, PBMC, cellules souches mésenchymateuses - à partir d'organes ou de tissus humains et animaux. De plus, nous réalisons l'expansion de lignées cellulaires tumorales stabilisées in vitro, des cultures de cellules primaires dissociées (neuronales, gliales, musculaires, hépatiques) et des cultures primaires organotypiques (issues du système nerveux central, des tissus épithéliaux et musculaires).



De l'isolement et de l'expansion des cellules à la cryoconservation, le service comprend :

• Acquisition de l'échantillon de tissu
• Dissociation enzymatique (trypsine, collagénase) ou mécanique du tissu
• Mise en place de culture cellulaire
• Culture cellulaire in vitro
• Préparation, étiquetage et cryoconservation (le cas échéant)
• Livraison au client ou conservation dans notre biobanque

Les lignées cellulaires doivent être stockées dans des vapeurs d'azote en lots homogènes, étiquetés avec le nom, le code du lot et la date de congélation. De cette façon, les contrôles de qualité aléatoires sur des tubes simples sont représentatifs de tous les échantillons appartenant au même lot.

La création d'une banque de cellules est un processus crucial dans la production de matériel biologique. L'équipe de bioKryo Italie, forte de sa longue expérience dans ce domaine, fournit des services d'expansion de lignées cellulaires et de préparation de banques de cellules mères et de travail. Ce service vous aidera à rationaliser vos tests et vos délais d'exécution, à éviter les opérations bancaires en série, représentant ainsi une solution idéale pour vos précieuses cellules humaines ou animales ; soit générées à partir de tissus ou de sang, soit déjà établies en tant que lignées cellulaires (c'est-à-dire immortalisées, recombinantes stables, tumorales, lignées cellulaires iPS et cellules souches).

Le service d'expansion et de génération de banque cellulaire comprend :

Création de banques MCB/WCB composées d'un nombre de tubes étiquetés selon l'indication du client (de 20 à 200 cryovials par lignée cellulaire). La cryoconservation est effectuée à l'aide de milieux de congélation qualifiés commercialement.

• Croissance et expansion de la lignée cellulaire pour obtenir le nombre de cellules nécessaires pour congeler le lot "master".
• Décongeler et dilater un tube du "master" pour obtenir le nombre de cellules nécessaires au projet (“working” batch).
• Essais de viabilité cellulaire après décongélation et chaque passage couplés à l'acquisition d'images de la morphologie cellulaire à différentes confluences.
• Surveillance de la courbe de croissance cellulaire et calcul du temps de duplication.
• Tests de stérilité et d'identité (sur demande).
• Livraison ou conservation des cellules contrôlées à la demande en termes de viabilité, de vérification d'identité et d'absence de contamination.

Le sang est constitué d'une suspension de cellules, d'érythrocytes (globules rouges), de leucocytes (globules blancs) et de thrombocytes (plaquettes) dans un liquide (plasma) composé principalement d'eau, de protéines, d'hormones, de glucose et de facteurs de coagulation. Le sérum, quant à lui, est ce qui reste du sang après avoir éliminé les éléments cellulaires et les facteurs de coagulation.

Le sang et ses dérivés sont la source de plusieurs molécules et produits d’analyse, tels que l'ADN génomique, les acides nucléiques circulants, les métabolites, les hormones et les cytokines. Ces éléments sont facilement accessibles et peuvent être obtenus à partir de patients et de personnes en bonne santé avec des procédures non invasives (une simple prise de sang) et fournissent des informations précieuses pour les communautés de recherche biomédicale, pharmaceutique, biotechnologique et universitaire.

bioKryo Italy effectue les services de séparation des composants sanguins suivants :

• Plasma
  
  La séparation du plasma du sang périphérique prélevé avec des anticoagulants (par exemple EDTA, héparine) est réalisée par centrifugation. Environ 2 à 4 ml de plasma sont isolés d'un tube de 10 ml de sang total, généralement aliquotés dans un volume de 1 ml et conservés à -80 ° C.

• Sérum
  
  La séparation du sérum du sang périphérique prélevé sans anticoagulants est réalisée par centrifugation. Environ 2 à 4 ml de sérum sont isolés d'un tube de 10 ml de sang total, généralement aliquotés dans un volume de 1 ml et conservés à -80 ° C.

• Buffy Coat
  
  La couche leucocytaire constituée d'un mélange de lymphocytes, de monocytes, de granulocytes et de plaquettes est isolée du sang périphérique par centrifugation. Le buffy coat isolé est conservé à –80°C.

• PBMC
  
  Les cellules mononucléaires du sang périphérique contiennent des leucocytes mononucléaires tels que des lymphocytes (cellules T, cellules B, cellules NK), des monocytes, des cellules dendritiques et des basophiles. L'isolement des PBMC est réalisé par centrifugation en gradient de densité (par exemple Ficoll TM). Après isolement, le nombre de PMBC et la viabilité sont évalués pour chaque isolement et les cellules sont cryoconservées dans de la vapeur d'azote.

Le service de traitement des échantillons sanguins comprend :

• Fractionnement et isolement rapides des composants sanguins
• Évaluation de la viabilité si nécessaire et sur demande
• Préparation et étiquetage des tubes cryogéniques contenant des composants sanguins
• Livraison ou stockage d'échantillons biologiques à différentes températures
• Caractérisation des échantillons biologiques par différentes méthodes biochimiques et moléculaires

Pour de meilleurs résultats, les échantillons de sang doivent arriver à bioKryo Italie dans les deux à quatre heures suivant le prélèvement et traitées dans un délai d'un jour après réception.

Une standardisation rigoureuse de la collecte, du traitement et du stockage du matériel biologique est essentielle pour garantir la reproductibilité et la comparabilité des résultats obtenus. En particulier, pour produire des données biomoléculaires et omiques valides et robustes, les chercheurs doivent s'appuyer sur des acides nucléiques de haute qualité.

bioKyo Italie fournit des services de purification d'acides nucléiques à partir d'un large éventail de types d'échantillons, y compris le sang total, le plasma, le sérum, le buffy coat, les tissus et les cellules cultivées in vitro, en utilisant des méthodes commerciales standardisées pour garantir une pureté et un rendement élevés.

• ADN
  
  L'isolement de l'ADN est une étape cruciale pour tous les laboratoires de recherche qui s'appuient sur les technologies génomiques (par exemple, le séquençage de nouvelle génération, l'amplification par PCR et l'analyse de génotypage par puce électronique) pour les études génétiques de maladies humaines ou pour développer de nouveaux biomarqueurs et outils de diagnostic. Nous effectuons des services de purification d'ADN et, pour les applications génomiques nécessitant un ADN génomique de haut poids moléculaire, nous évaluons également l'intégrité de l'ADN à l'aide d'une plateforme microfluidique pour l'estimation du DIN (DNA Integrity Number).
  
   
• ARN
  
  L'extraction d'ARN représente une étape clé pour les laboratoires de recherche réalisant des études de biologie moléculaire et cellulaire qui s'appuient sur des technologies génomiques telles que la PCR en temps réel, l'analyse de l'expression génique sur microarray et le séquençage de nouvelle génération (RNA-Seq). Nous effectuons des services de purification d'ARN et, sur demande, évaluons l'intégrité de l'ARN à l'aide d'une plateforme microfluidique pour estimer le RIN (RNA Integrity Number).
  
   
• microARN
  
  Les microARN sont de petites molécules d'ARN non codantes simple brin agissant comme régulateurs de l'expression des gènes. L'analyse de l'expression des microARN peut fournir des informations importantes sur l'interprétation de la pathogenèse de nombreuses maladies humaines. L'expression altérée des microARN dans plusieurs conditions pathologiques les rend attractifs comme biomarqueurs diagnostiques et pronostiques, et comme cibles moléculaires à des fins thérapeutiques. Nous effectuons des services de purification de microARN à partir d'un large éventail de types d'échantillons, y compris le sang total, le plasma, le sérum, la couche leucocytaire, les tissus et les cellules cultivées.

Le service de purification des acides nucléiques comprend :

• Extraction d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques.
• Quantification précise des acides nucléiques purifiés par des méthodes fluorimétriques.
• Évaluation de l'intégrité de l'ADN/ARN extrait à l'aide d'une plateforme microfluidique pour l'estimation du DIN/RIN (sur demande).
• Préparation et étiquetage des tubes.
• Livraison ou stockage.

Authentification de la lignée cellulaire - Profil STR

Les cellules cultivées sont de précieux outils de recherche biomédicale. Cependant, l'identification erronée et la contamination croisée des lignées cellulaires représentent un problème permanent qui peut compromettre la validité et la robustesse des résultats. Pour cette raison, les revues scientifiques et les agences de financement exigent des chercheurs qu'ils s'assurent que leurs lignées cellulaires sont authentiques. L'analyse des marqueurs génétiques polymorphes STR (Short Tandem Repeat) représente l'étalon-or pour établir l'identité des échantillons humains. En fournissant une empreinte génétique hautement spécifique, le profilage STR permet d'identifier de manière unique les lignées cellulaires humaines et de s'assurer qu'elles ne sont ni contaminées par d'autres cellules ni qu'elles diffèrent génétiquement des stocks d'origine.

Le service d'authentification de profil STR comprend :

• Purification et quantification de l'ADN génomique à partir de cellules vivantes/congelées.
• Co-amplification PCR et détection par électrophorèse capillaire de neuf marqueurs moléculaires STR autosomiques (D21S11, D7S820, CSF1PO, TH01, D13S317, D16S539, vWA, TPOX, D5S818) avec l'amélogénine identifiant le sexe.
• Analyse des profils obtenus.
• Description complète du profil STR et rapport d'analyse incluant l'électrophérogramme

Le profil STR est comparé à la référence standard de la lignée cellulaire pour confirmer son identité.

Test d'instabilité des microsatellites (MSI)

Les microsatellites sont de courtes séquences d'ADN répétées en tandem (une à six paires de bases de longueur) réparties dans tout le génome humain. L'instabilité des microsatellites (MSI) représente l'hypermutabilité dans ces sites en raison d'une réparation des mésappariements d'ADN (MMR) altérée. L'instabilité génomique survient dans une variété de néoplasmes humains et peut être la première preuve d'un déficit en MMR. Le statut MSI est un biomarqueur prédictif d'une réponse cancéreuse positive aux immunothérapies telles que les inhibiteurs de blocage des points de contrôle immunitaires.

Le service MSI est destiné à des fins de recherche et comprend :

• Purification et quantification de l'ADN génomique à partir de cellules vivantes/congelées.
• Co-amplification PCR et détection par électrophorèse capillaire de cinq marqueurs répétés mononucléotidiques (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 et MONO-27) et de deux marqueurs répétés pentanucléotidiques (Penta C et Penta D).
• Analyse des profils obtenus. La présence de nombreux allèles supplémentaires dans le profil microsatellite indique une instabilité du génome.
• Description complète du profil MSI et rapport d'analyse incluant l'électrophérogramme.

La contamination des cultures cellulaires par des bactéries, des champignons et des mycoplasmes est un phénomène de laboratoire répandu qui peut compromettre la reproductibilité des résultats expérimentaux en modifiant des paramètres cellulaires tels que le métabolisme, la croissance et la vitalité. La contamination virale peut provenir de la source d'origine des lignées cellulaires dérivées ou de l'introduction fortuite de virus au cours des processus de fabrication.

La contamination des cultures cellulaires ne peut pas toujours être facilement détectée et peut être très insidieuse. Les contaminants restent souvent non détectés jusqu'à ce que les cellules montrent des signes évidents d'altérations morphologiques. Par conséquent, les cultures cellulaires doivent être régulièrement surveillées avec des méthodes sensibles pour détecter la contamination dans les phases précoces.

Bactéries/ Champignons

Nous réalisons des tests de stérilité par ensemencement direct de surnageant de culture cellulaire sur milieu solide pour la détection de bactéries et champignons. Plus précisément, l'analyse est effectuée en double pour chaque échantillon sur Columbia Agar additionnée de plaques de sang de mouton à cinq pour cent pour la détection des bactéries et de Sabouraud Dextrose Agar (SDA) pour les champignons. Des souches de référence pour les bactéries et les champignons sont utilisées selon la Pharmacopée européenne (EP 2.6.1).

Mycoplasme

Les mycoplasmes sont de très petits organismes procaryotes qui ne peuvent pas être détectés par inspection microscopique et peuvent rester cachés dans les cultures cellulaires pendant de longues périodes. Par conséquent, le dépistage de routine des lignées cellulaires pour la contamination par les mycoplasmes est d'une importance primordiale. Nous réalisons l'analyse des mycoplasmes sur le surnageant des cultures cellulaires en nous basant sur deux types de tests différents :

• PCR en point final ciblant la région codante de l'ARNr 16S hautement conservée du génome des mycoplasmes permettant la détection d'un large éventail d'espèces de mycoplasmes,
• PCR quantitative (qPCR) ciblant une région hautement conservée au sein du génome du mycoplasme pour détecter toutes les espèces incluses dans le chapitre 2.6.7 de la Pharmacopée européenne (EP 2.6.7).

Dépistage viral

Nous effectuons des analyses pour détecter le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), l'hépatite C (VHC), l'hépatite B (VHB) et le cytomégalovirus (CMV) par analyse RT-PCR après purification des acides nucléiques viraux à partir de cellules cultivées.

Le service d'analyse de contamination cellulaire comprend :

• Vérification de l'absence de contamination par des bactéries, champignons, mycoplasmes et virus dans les lignées cellulaires,
• Interprétation complète des résultats par un spécialiste,
• Rapport d'analyse pour chaque lignée cellulaire analysée.

Les cellules cultivées peuvent acquérir des anomalies génomiques dues à une culture in vitro à long terme ou à des manipulations génétiques (c'est-à-dire l'introduction d'ADN exogène lors de la reprogrammation ou des processus d'édition CRISPR-Cas9). Les altérations de la structure génomique cellulaire peuvent modifier radicalement les caractéristiques cellulaires, et ainsi nuire à la robustesse des résultats dans les expériences de recherche en aval. Pour une utilisation fiable des cultures cellulaires, il est donc nécessaire d'effectuer un suivi périodique pour vérifier les aberrations génomiques. Grâce à la longue expérience spécialisée de nos opérateurs dans le contrôle génomique cellulaire, bioKryo Italie fournit des services cytogénétiques visant à confirmer la stabilité structurelle et numérique chromosomique des lignées cellulaires de recherche. Nos analyses sont effectuées sur différents types de cellules, telles que les lignées cellulaires stabilisées, les lignées cellulaires souches embryonnaires (ES), souches pluripotentes induites (iPS), somatiques et tumorales. Les tests sont effectués à des fins de recherche uniquement et non pour des analyses diagnostiques ou de dépistage prénatal.

Q-banding Caryotype

L'analyse du caryotype est une technique conventionnelle de marquage chromosomique qui représente le test de référence pour détecter les anomalies génétiques dans les cultures cellulaires. Il permet d'évaluer le nombre et la structure des chromosomes pour identifier les réarrangements (inversions, duplications/délétions, translocations équilibrées et non équilibrées, aneuploïdie) avec une résolution > 5-10 Mb et un mosaïcisme > 10 %. Nous effectuons une analyse du caryotype par la méthode Q-banding impliquant l'utilisation du colorant fluorescent Quinacrine. Notre microscope à fluorescence qualifié entièrement équipé et le module logiciel GenASIs Bandview pour le caryotypage fournissent des analyses précises, reproductibles et standardisées.

Caryotype spectral - SKY

En cas de réarrangements interchromosomiques complexes, la technique du caryotype spectral (SKY) permet la détection d'anomalies génétiques cryptiques ou submicroscopiques qui ne peuvent être résolues par la cytogénétique conventionnelle. Cette méthode est basée sur l'hybridation de sondes marquées avec des colorants fluorescents distincts dans différentes combinaisons afin de générer des couleurs spectralement différentes pour chaque chromosome.

❖ Avec Q-banding et SKY, les chromosomes sont classés selon les directives ISCN 2016 : An International System for Human Cytogenomic Nomenclature

Le service de caryotype Q-banding/spectral (SKY) comprend :

• Décongélation et expansion des cellules (humaines et murines)
• Propagation de la métaphase chromosomique et évaluation du nombre/qualité
• Coloration pour Q-banding/hybridation pour SKY
• Analyse d'au moins 20 métaphases en bande Q pour chaque lignée cellulaire
• Au moins une image de haute qualité d'un caryotype représentatif dans un format prêt à être publié
• Analyse complète des résultats et consultation interprétative par un spécialiste
• Rapport d'analyse pour chaque lignée cellulaire analysée

Caryotype moléculaire - aCGH

Le caryotype moléculaire à haute résolution basé sur des array platforms permet la détection d'aberrations et de réarrangements qui seraient négligés avec les investigations chromosomiques traditionnelles. Par exemple, les variations du nombre de copies (CNV) ou les conditions de perte hétérozygote (LOH) peuvent être caractérisées à l'aide d'une hybridation génomique comparative basée sur un réseau (aCGH). Cette méthode est capable d'identifier des anomalies génomiques aussi petites que quelques milliers de paires de bases et de définir précisément la région génomique altérée et les gènes impliqués.

L'ensemble de la prestation à partir de cultures cellulaires vivantes ou congelées comprend :

• Décongélation et expansion des cellules.
• Purification et quantification de l'ADN génomique.
• Marquage ADN et hybridation avec la plateforme Agilent.
• Extraction et analyse des données avec le logiciel Agilent Cytogenomics.
• Au moins une image de haute qualité dans un format adapté à la publication.
• Analyse complète des résultats et consultation interprétative par un spécialiste.
• Rapport d'analyse pour chaque lignée cellulaire analysée, y compris les données brutes.

La découverte des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) a révolutionné la recherche basée sur la médecine personnalisée. Les IPSC sont un type de cellules pluripotentes qui peuvent être générées à partir de cellules hautement différenciées (généralement des fibroblastes et des PBMC) en introduisant plusieurs facteurs de pluripotence. Cette technologie permet aux chercheurs d'obtenir des cellules à un stade embryonnaire avec la capacité d'entreprendre de multiples destins de différenciation sans matériel embryonnaire et sans soucis éthiques associés.

Les iPSC présentent une source alternative prometteuse de cellules souches spécifiques au patient avec un grand potentiel de développements thérapeutiques dans le domaine de la médecine régénérative. Ils constituent également une excellente plate-forme expérimentale pour la modélisation de maladies, le criblage de médicaments et les études toxicologiques.

Le processus de génération d'iPSC correctement reprogrammés en termes de caractéristiques de pluripotence et de stabilité génomique prend du temps et nécessite une vaste expérience technique.

Génération de hiPSC à partir de cellules somatiques adultes

Nous proposons les services de génération de hiPSC à partir de fibroblastes et de PBMC de donneurs sains ou dérivés de patients en utilisant l'administration avancée de facteurs de reprogrammation iPSC utilisant à la fois des vecteurs épisomiques et le virus Sendai. Une fois générés, les iPSC sont testés en termes de pluripotence et leur capacité à se différencier dans les trois couches embryonnaires (trilineage differenciation). Une fois générées, les cellules sont également évaluées pour la stabilité génomique et l'absence de contamination fongique/bactérienne/mycoplasme.

Le service de reprogrammation cellulaire comprend :

• Décongélation, récupération et culture de fibroblastes ou PBMC.
• Transfection/transduction de facteurs de reprogrammation.
• Sélection, isolement et expansion de colonies iPSC générées une seule fois.
• Évaluation (morphologie, pluripotence, différenciation des trilignages) et expansion de trois clones iPS pour chaque lignée cellulaire
• Evaluation de l'absence de vecteurs de transduction
• Test de stérilité pour les bactéries et les champignons dans chaque clone produit
• Analyse des mycoplasmes par PCR dans chaque clone généré
• Cryoconservation d'au moins cinq tubes cryogéniques pour chaque clone (> 1x106 cellules/tube)
• Test de viabilité après décongélation de chaque clone
• Livraison ou stockage dans nos locaux

Les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) sont capables de se différencier en d'autres types de cellules et de s'auto-renouveler indéfiniment sans sénescence. En conséquence, ils représentent une source pratiquement illimitée de divers types de cellules, y compris des cellules difficiles à obtenir à partir de tissus primaires (tels que les cardiomyocytes, les neurones et les mégacaryocytes). De plus, ils représentent un outil puissant pour développer des modèles d'étude hautement physiologiques et spécifiques au patient. Les opérateurs de bioKryo Italie ont collaboré à plusieurs études sur les cellules souches et les iPSCs, et mettent leur expérience à disposition pour des services de différenciation personnalisables des iPSCs en différents types cellulaires.

Différenciation cardiomyocytaire des hiPSCs

Nous appliquons un protocole validé et robuste afin d'effectuer la différenciation des iPSCs en cardiomyocytes fonctionnels pouvant être utilisés comme modèles in vitro pour des études électrophysiologiques, des analyses biochimiques, le développement de nouveaux médicaments, le criblage de toxicité et des études génétiques. Les cardiomyocytes ainsi obtenus représentent une alternative valable aux cellules souches embryonnaires et aux modèles animaux. Nous générons des cardiomyocytes dérivés d'iPSCs à partir de donneurs sains ou de personnes souffrant de problèmes de santé.

L'ensemble de la prestation comprend :

• Décongélation, expansion et validation des iPSCs.
• Différenciation cardiomyocytaire des iPSCs.
• Images en contraste de phase des lignées iPSCs parentales après expansion et différenciation en cardiomyocytes.
• Enregistrement vidéo de l'activité pulsatoire de la culture des cardiomyocytes.
• Caractérisation des cellules différenciées par coloration immunocytochimique avec trois marqueurs spécifiques (cTNT, SMA, Nkx2.5).
• Livraison de cardiomyocytes fonctionnels et rapport d'analyse pour chaque lignée cellulaire analysée.

Différenciation des mégacaryocytes des hiPSCs

Les mégacaryocytes (MKs) sont des cellules hématopoïétiques hautement spécialisées responsables de la production et de la libération de plaquettes qui jouent un rôle essentiel dans l'hémostase primaire et la coagulation sanguine. Les MKs sont des cellules myéloïdes représentant seulement env. un pour cent de la population cellulaire résidant dans la moelle osseuse. La génération ex vivo de MK d'iPSCs fournit une source illimitée de plaquettes qui peuvent être cryoconservées et mises à disposition sur demande sans qu'il soit nécessaire d'effectuer de fréquents prélèvements sanguins chez le patient.

Au moyen d'un protocole validé et robuste, nous effectuons la différenciation des iPSCs en mégacaryocytes fonctionnels pouvant être utilisés comme modèles in vitro pour des essais biochimiques et pharmacologiques. Nous générons des mégacaryocytes dérivés d'iPSC à partir de donneurs sains ou de personnes souffrant de problèmes de santé.

L'ensemble de la prestation comprend :

• Décongélation, expansion et validation des iPSCs.
• Différenciation des mégacaryocytes des iPSCs.
• Images en contraste de phase des lignées iPSCs parentales après expansion et différenciation en mégacaryocytes.
• Caractérisation de cellules différenciées par cytométrie en flux pour l'expression du marqueur de surface spécifique des mégacaryocytes CD41 et pour l'évaluation de la ploïdie.
• Livraison de mégacaryocytes fonctionnels et rapport d'analyse pour chaque lignée cellulaire analysée.

Différenciation trilinéaire des hMSC

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs), également appelées cellules stromales multipotentes, représentent un exemple de cellules souches adultes. Outre la moelle osseuse, les hMSCs peuvent être isolées d'une grande variété d'autres tissus, tels que le tissu adipeux, le sang de cordon, le placenta, la peau et les follicules pileux. Les hMSCs recèlent un grand potentiel dans la régénération tissulaire et la thérapie cellulaire en raison de leur capacité à produire un grand nombre de cellules spécialisées, notamment les adipocytes, les ostéocytes, les chondrocytes, les cellules épithéliales, les cellules de type neurone et les hépatocytes. En plus de l'isolement des tissus, l'utilisation des hMSCs nécessite la confirmation de leur potentiel souche, c'est-à-dire une vérification rigoureuse de leur capacité à se différencier en adipocytes, chondrocytes et ostéoblastes lorsqu'ils sont cultivés in vitro (différenciation trilineage).

L'ensemble de la prestation comprend :

• Décongélation et expansion des hMSCs à partir de tissus d'origines différentes.
• Suivi morphologique.
• Évaluation de la différenciation des trilignages par coloration avec :
• ○ Rouge Alizarine pour identifier la présence de nodules minéralisés et de dépôts de calcium qui sont des caractéristiques spécifiques de la différenciation ostéogénique.
• ○ Oil Red pour révéler les dépôts de triglycérides, principaux composants des dépôts lipidiques présents dans les adipocytes.
• ○ Bleu Alcian pour mettre en évidence la formation d'agrégats de cartilage et l'accumulation de protéoglycanes.
• Analyse des niveaux d'expression de marqueurs spécifiques par qRT-PCR.
• Livraison de cellules différenciées fonctionnelles et rapport d'analyse pour chaque lignée cellulaire analysée.

Génération et différenciation spécifique aux tissus d’organoïdes/sphéroïdes

Les cultures cellulaires sont des outils essentiels pour la recherche fondamentale, translationnelle et préclinique. En plus du modèle de culture cellulaire classique, qui prévoit la croissance in vitro de cellules en monocouche (2D), les systèmes de croissance cellulaire 3D ont attiré beaucoup d'attention ces dernières années. Les systèmes 3D in vitro permettent la formation d'agrégats cellulaires, appelés organoïdes (ou sphéroïdes). Ces structures reproduisent plus fidèlement l'architecture des organes et tissus humains que les monocouches cellulaires, et représentent ainsi des modèles prometteurs pour l'étude des processus physiologiques. De plus, les organoïdes se prêtent à toutes les analyses cellulaires/moléculaires/pharmacologiques déjà développées pour les lignées cellulaires traditionnelles. Leur ressemblance avec les organes humains signifie que l'étude des organoïdes et des sphéroïdes recèle un grand potentiel pour la recherche translationnelle.

À partir de cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC), nous générons des organoïdes cérébraux humains capables de récapituler les caractéristiques du développement cortical humain.

L'ensemble de la prestation comprend :

• Décongélation, expansion et validation des iPSCs.
• Différenciation tissulaire spécifique des iPSCs.
• Images en contraste de phase des deux lignées iPSCs après l'expansion et des organoïdes à différents stades de croissance.
• Caractérisation avec des marqueurs spécifiques par coloration par immunofluorescence.
• Livraison d'organoïdes fonctionnels.