Servizi di laboratorio

bioKryo Italy laboratory area

Servizi di laboratorio

  • Biologia cellulare (isolamento ed espansione di linee cellulari, generazione di Master e Working Cell Banks)
  • Biologia molecolare (estrazione e controllo di qualità di acidi nucleici)
  • Processamento di campioni ematici (plasma, siero, buffy coat, PBMC)
  • Genotipizzazione (autenticazione di linee cellulari tramite profilo STR, test di instabilità dei microsatelliti (MSI))
  • Microbiologia (batteri, funghi, micoplasma, screening virale)
  • Citogenetica (cariotipo Q-banding, cariotipo spettrale (SKY), cariotipo molecolare-aCGH)
  • Servizi dedicati di cellule staminali:
    ○  Riprogrammazione cellulare (generazione di hiPSC da cellule somatiche adulte)
    ○  Differenziamento tessuto-specifico di hiPSC (cardiomiociti e megacariociti)
    ○  Differenziamento di hMSC
    ○  Generazione di organoidi/sferoidi

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Isolamento ed espansione di linee cellulari

La coltura cellulare è una tecnica usata in laboratorio che permette di crescere le cellule in vitro in condizioni controllate in termini di temperatura e nutrienti. Le cellule in coltura rappresentano i principali strumenti utilizzati nella biologia cellulare e molecolare e costituiscono eccellenti sistemi modello per lo studio della fisiologia, della biochimica e della genetica delle cellule. Inoltre, le colture cellulari ricoprono un ruolo fondamentale nella produzione di vaccini virali, sviluppo di nuovi farmaci e nei saggi di tossicità.

Le linee cellulari primarie derivano dall’isolamento di una o più tipologia cellulare da un campione di tessuto o organi. Quando poste in coltura, tali cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari, poi vanno incontro a senescenza e smettono di dividersi. Poiché derivano direttamente dal tessuto dei donatori, le cellule primarie conservano le principali caratteristiche fisiologiche del tessuto di origine e sono quindi considerate un potente strumento in vitro per lo studio di specifiche malattie.

Effettuiamo l’isolamento di cellule di diverse tipologie - quali cellule epiteliali, fibroblasti, cheratinociti, PBMC, cellule staminali mesenchimali - da organi o tessuti umani e animali. Inoltre, effettuiamo l’espansione di linee cellulari tumorali di diverso tipo stabilizzate in vitro, di colture primarie dissociate (neuronali, gliali, muscolari, epatiche) e di colture primarie organotipiche (da sistema nervoso centrale, epitelio, muscolo).

Il servizio, dall’isolamento ed espansione fino al congelamento delle cellule, comprende:
Acquisizione del campione tissutale
● Dissociazione enzimatica (tripsina, collagenasi) o meccanica del tessuto
● Allestimento di una coltura cellulare
● Incubazione e crescita in vitro delle cellule
● Preparazione, etichettatura e congelamento (dove applicabile)
● Consegna oppure conservazione

Generazione di Master/Working Cell Bank

Le linee cellulari devono essere conservate in vapori di azoto in lotti omogenei, etichettati con nome, codice del lotto e data di congelamento. In questo modo, i controlli di qualità effettuati a campione su singole provette sono rappresentativi di tutti i campioni appartenenti a uno stesso lotto. Grazie a un'esperienza pluriennale dei nostri operatori in questo campo e al continuoaggiornamento mediante la partecipazione a corsi di formazione e seminari, bioKryo Italy fornisce servizi di espansione di linee cellulari e preparazione di Master e Working Cell Banks, consentendo una semplificazione e una standardizzazione dei flussi di lavoro sperimentali, evitando il serial banking. Il nostro servizio di espansione e generazione di cell banks è la soluzione ideale per le tue preziose cellule umane o animali generate direttamente da tessuti o sangue oppure già stabilizzate come linee cellulari (es.: linee cellulari immortalizzate, tumorali, linee iPS e cellule staminali).

Il servizio di espansione e generazione di cell banks, comprende:
Creazione di Master e/o Working Cell Banks con un numero di provette su richiesta (da 20 a 200 cryovials per linea cellulare etichettate su indicazione del cliente). La crioconservazione avviene con mezzi di congelamento commercialmente qualificati.

  • Coltivazione ed espansione della linea cellulare fino a ottenere il numero di cellule necessario per congelare il lotto «Master»
  • Scongelamento di una provetta del lotto «master», ed espansione fino a ottenere un numero di provette sufficienti per il progetto (lotto «Working»)
  • Verifica della vitalità cellulare post scongelamento e a ogni passaggio e acquisizione di immagini della morfologia cellulare a diversa confluenza
  • Monitoraggio della curva di crescita cellulare e determinazione del tempo di duplicazione
  • Analisi della sterilità e verifica della identità (su richiesta)
  • Consegna o conservazione delle cellule controllate su richiesta in termini di vitalità, verifica di identità e assenza di contaminazioni

Processamento di Campioni Ematici

Il sangue è costituito da una sospensione di cellule, eritrociti (globuli rossi), leucociti (globuli bianchi) e trombociti (piastrine) in un liquido composto principalmente da acqua, proteine, ormoni, glucosio e fattori di coagulazione (plasma). Il siero è invece ciò che rimane del sangue dopo aver allontanato gli elementi cellulari e i fattori di coagulazione.

Dal sangue e i suoi derivati si estraggono diverse molecole e analiti quali DNA genomico, acidi nucleici circolanti, metaboliti, ormoni e citochine. Questi elementi presenti nella circolazione sanguigna sono facilmente accessibili e ottenibili da pazienti e individui sani con procedure semplici e non invasive (un prelievo di sangue) e forniscono informazioni preziose per le comunità di ricerca biomedica, farmaceutica, biotecnologica e accademica.

bioKryo Italy esegue i seguenti servizi di separazione dei componenti ematici:

  • Plasma
    La separazione del plasma da sangue intero periferico raccolto con anticoagulanti (ad es. EDTA, eparina) viene eseguita mediante centrifugazione. Da una provetta da 10 ml di sangue intero vengono isolati circa 2-4 ml di plasma, tipicamente aliquotato in un volume di 1 ml e conservato a –80°C.
  • Siero
    La separazione del siero dal sangue intero periferico raccolto senza anticoagulanti viene eseguita mediante centrifugazione. Da una provetta da 10 ml di sangue intero vengono isolati circa 2-4 ml di siero, tipicamente aliquotato in un volume di 1 ml e conservato a –80°C.
  • Buffy Coat
    Il buffy coat contenente una miscela di linfociti, monociti, granulociti e piastrine viene isolato dal sangue periferico mediante centrifugazione. Il buffy coat isolato viene conservato a –80°C.
  • PBMC
    Le cellule mononucleate del sangue periferico comprendono tutti i leucociti mononucleati come i linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK), monociti, cellule dendritiche e basofili. Vengono isolati mediante centrifugazione in gradiente di densità (ad es. FicollTM). Dopo l’isolamento, si determina la loro quantità e vitalità e vengono crioconservati in vapori di
    azoto.

Il servizio di processamento di campioni ematici, comprende:
● Frazionamento rapido e isolamento dei componenti del sangue
● Valutazione di vitalità ove applicabile e su richiesta
● Preparazione ed etichettatura delle provette criogeniche degli emocomponenti
● Consegna o conservazione dei campioni biologici a diverse temperature
● Caratterizzazione dei campioni biologici attraverso diverse metodiche biochimiche e molecolari

Per ottenere i migliori risultati, i campioni di sangue devono pervenire in bioKryo Italy entro 2-4 ore dalla raccolta ed elaborati entro 1 giorno dal ricevimento.

Estrazione e Controllo di Qualità di Acidi Nucleici

I campioni biologici rappresentano risorse essenziali e strategiche per la ricerca biomedica e per la nuova frontiera della medicina personalizzata. E’ fondamentale che il materiale biologico sia acquisito, conservato e anche processato in modo standardizzato e rigoroso. Queste condizioni sono imprescindibili affinché la ricerca possa garantire riproducibilità e comparabilità dei risultati ottenuti. In particolare, per produrre dati biomolecolari e omici validi e robusti, i ricercatori hanno bisogno di contare su acidi nucleici di alta qualità.

bioKryo Italy fornisce servizi di estrazione di acidi nucleici da un'ampia gamma di tipologia di campioni,
inclusi sangue intero, plasma, siero, buffy coat, tessuti e cellule coltivate in vitro, avvalendosi di metodi commerciali standardizzati per garantire elevata purezza e resa.

  • DNA
    L’isolamento del DNA è un passaggio cruciale per tutti i laboratori impegnati nello studio di geni implicati in malattie genetiche o nello sviluppo di nuovi biomarcatori e strumenti diagnostici mediante l’uso di tecnologie genomiche (ad es. il sequenziamento di nuova generazione, l'amplificazione PCR e l'analisi di genotipizzazione basata su array). Eseguiamo servizi di estrazione di DNA e su richiesta valutiamo l'integrità del DNA estratto, mediante analisi su piattaforma microfluidica per la stima del DIN (DNA Integrity Number) necessaria per le applicazioni genomiche che richiedono DNA genomico ad alto peso molecolare.

  • RNA
    Per i laboratori di ricerca, l'estrazione dell'RNA rappresenta un elemento fondamentale per molte applicazioni di biologia molecolare e cellulare, tra cui l'analisi dell'espressione genica mediante real time PCR o microarray e il sequenziamento di nuova generazione (RNA-Seq). Eseguiamo servizi di estrazione di RNA e su richiesta effettuiamo la valutazione dell'integrità dell’ RNA estratto, mediante analisi su piattaforma microfluidica per la stima del RIN (RNA Integrity Number).

  • microRNA
    I microRNA sono piccole molecole di RNA non codificante a singolo filamento che agiscono come regolatori dell’espressione genica. L’analisi dell’espressione dei microRNA e la loro eventuale disregolazione possono fornire importanti informazioni nell’interpretazione della patogenesi e nella formulazione della diagnosi di molte patologie umane. L'espressione alterata dei microRNA in numerose patologie li rende attraenti come biomarcatori diagnostici e prognostici e come bersagli molecolari a scopo terapeutico. Eseguiamo servizi di estrazione di microRNA da un'ampia gamma di tipi di campioni, inclusi sangue intero, plasma, siero, buffy coat, tessuti e cellule in coltura.

Il servizio di estrazione e controllo di qualità di acidi nucleici, comprende:
● Estrazione di acidi nucleici da campioni biologici
● L’accurata quantificazione degli acidi nucleici estratti mediante metodiche fluorimetriche
● Valutazione dell'integrità del DNA/RNA estratto mediante analisi su piattaforma microfluidica per la stima del DIN/RIN (su richiesta)
● Preparazione ed etichettatura delle provette
● Consegna o conservazione all’interno dell’area dedicata allo stoccaggio

Genotipizzazione

Autenticazione - Profilo STR

Le cellule in coltura sono inestimabili strumenti di ricerca biomedica. Poiché spesso molte linee cellulari sono identificate in modo erroneo o contaminate da altre cellule, i risultati sperimentali ottenuti rischiano di non avere robustezza e validità. La letteratura recente ha infatti sottolineato l'importanza dell'autenticazione delle linee cellulari che è attualmente richiesta per la pubblicazione da molte riviste scientifiche. Il test di elezione per questa verifica è l’analisi dei marcatori genetici polimorfici STR (Short Tandem Repeat). La profilazione consente di identificare in modo univoco le linee cellulari umane ed è essenziale per garantire che non siano contaminate da altre cellule e non differiscano geneticamente dalla fonte originaria.

Il servizio di autenticazione-profilo STR, include:

  • Estrazione e quantificazione del DNA genomico da cellule vive/congelate
  • Co-amplificazione PCR e rilevazione mediante elettroforesi capillare di 9 marcatori molecolari STR autosomici (D21S11,
  • D7S820, CSF1PO, TH01, D13S317, D16S539, vWA, TPOX, D5S818) insieme ad Amelogenina che identifica il sesso
  • Analisi dei profili ottenuti
  • Descrizione completa del profilo STR e rapporto comprensivo di elettroferogramma

Il profilo STR viene confrontato con lo standard di riferimento della linea cellulare per confermarne l'identità.

Test di instabilità dei microsatelliti (MSI)

I microsatelliti sono brevi sequenze di DNA non codificante, ripetute in tandem e costituite da unità di uno o pochi nucleotidi. L'instabilità dei microsatelliti (MSI) è una condizione di ipermutabilità che si traduce in una variazione della lunghezza di questi tratti di DNA dovuta all'inserimento o all'eliminazione di unità ripetute. Tale condizione, generalmente ascrivibile alla perdita di funzione delle proteine coinvolte nel sistema mismatch repair del DNA (MMR), si manifesta in una varietà di neoplasie umane ed è considerato un fattore predittivo di risposta alle immunoterapie come gli inibitori del blocco del checkpoint immunitario.

Il servizio di MSI per scopi di ricerca, comprende:

  • Estrazione e quantificazione del DNA genomico da cellule vive/congelate
  • Co-amplificazione PCR e rilevazione mediante elettroforesi capillare di cinque marcatori di ripetizione mononucleotidica (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27) e due di ripetizione pentanucleotidica (Penta C e Penta D)
  • Analisi dei profili ottenuti. La presenza di numerosi alleli extra nel profilo dei microsatelliti indica instabilità del genoma
  • Descrizione completa del profilo MSI e rapporto di analisi inclusivo di elettroferogramma

Microbiologia

La contaminazione cellulare, in particolare, la presenza di batteri, funghi e micoplasma può modificare il metabolismo, la crescita e la vitalità delle cellule, mettendo a rischio la riproducibilità degli esperimenti. La contaminazione virale inoltre può derivare dalla fonte originale delle linee cellulari derivate o dall'introduzione accidentale di virus durante i processi di produzione.

Mentre in alcuni casi la contaminazione delle colture cellulari è facilmente individuabile, in altri è molto più insidiosa e, spesso, non rilevata fino a quando le cellule non mostrano segni evidenti di alterazioni morfologiche. Di conseguenza, le colture cellulari dovrebbero essere controllate regolarmente con metodi sensibili per individuare precocemente eventuali contaminazioni.

Bacteria/ Fungi 
Eseguiamo test di sterilità mediante inoculazione diretta di terreno di coltura cellulare su terreno solido per la rilevazione di batteri e funghi. In particolare, l’analisi viene condotta in duplicato per ogni campione su piastre Columbia Agar with 5% Sheep Blood per la rilevazione di batteri e Sabouraud Dextrose Agar (SDA) per funghi, con ceppi di riferimento per batteri e funghi secondo la Farmacopea Europea (EP 2.6.1).

Mycoplasma
I micoplasmi sono organismi procarioti molto piccoli non rilevabili mediante ispezione microscopica e possono rimanere inosservati nelle colture cellulari per lunghi periodi. Pertanto, lo screening di routine delle linee cellulari per la contaminazione da micoplasma è essenziale. Eseguiamo l’analisi del micoplasma sul surnatante delle colture cellulari basata su due diverse tipologie di test:

  • PCR endpoint mirata alla regione codificante dell'rRNA 16S che è altamente conservata nel genoma del micoplasma e che consente il rilevamento di un'ampia gamma di specie di Micoplasma
  • PCR quantitativa (qPCR) mirato a una regione altamente conservata all'interno del genoma del micoplasma per rilevare tutte le specie incluse nel capitolo 2.6.7 della Farmacopea Europea (EP 2.6.7)

Screening virale
Eseguiamo un servizio di analisi per la rilevazione del virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell'epatite C (HCV), dell'epatite B (HBV) e del citomegalovirus (CMV) mediante analisi di RT-PCR previa estrazione degli acidi nucleici virali dalle cellule in coltura.

Il servizio di contaminazione cellulare, comprende:
● Verifica dell’assenza di contaminazioni da batteri, funghi, micoplasma e virus in linee cellulari
● Interpretazione completa dei risultati da parte di uno specialista
● Rapporto di analisi per ogni linea cellulare analizzata

Citogenetica

Le cellule in coltura possono acquisire anomalie genomiche a causa delle condizioni di crescita in vitro protratte per lungo tempo o di manipolazioni genetiche (come l’introduzione di DNA esogeno durante il processo di riprogrammazione o editing CRISPR-Cas9). Le alterazioni dell’assetto genomico cellulare possono modificare drasticamente le caratteristiche cellulari rendendo poco attendibili i risultati sperimentali ottenuti. Per un uso affidabile delle colture cellulari è quindi necessario condurre un monitoraggio periodico per la comparsa di aberrazioni genomiche. Grazie a un'esperienza specialistica pluriennale dei nostri operatori nel campo del controllo genomico delle cellule, bioKryo Italy fornisce diversi servizi citogenetici per confermare la stabilità strutturale e numerica cromosomica delle linee cellulari. Le analisi sono effettuate su diverse tipologie di cellule, quali linee cellulari stabilizzate, embrionali staminali (ES), pluripotenti indotte (iPSC) e tumorali. I test vengono effettuati solo con finalità di ricerca e non a scopo diagnostico o di screening prenatale.

Cariotipo Q-banding
Mediante l’analisi di cariotipo (tecnica convenzionale di bandeggio cromosomico), considerata il test gold standard per rilevare anomalie genetiche nelle colture cellulari, è possibile valutare il numero e la struttura dei cromosomi e identificare riarrangiamenti cromosomici (inversioni, duplicazioni/delezioni, traslocazioni bilanciate e sbilanciate, aneuploidie) microscopici con una risoluzione >5-10 Mb e con mosaicismo >10%. Effettuiamo l’analisi del cariotipo con tecnica del bandeggio-Q ottenuto mediante l’impiego di un colorante fluorescente, la Quinacrina. Il nostro microscopio a fluorescenza completamente attrezzato e il software GenASIs Bandview permettono analisi accurate, ripetibili e
standardizzate.

Cariotipo spettrale- SKY
In caso di eventuali riarrangiamenti intercromosomici complessi, la tecnica del cariotipo spettrale- SKY, permette di rilevare anomalie genetiche criptiche o submicroscopiche difficilmente identificabili dalla citogenetica convenzionale. Si tratta di un metodo basato sull'ibridazione di sonde marcate con diversi fluorocromi grazie al quale tutte le coppie di cromosomi vengono visualizzate contemporaneamente in diversi colori.

❖ Sia con bandeggio-Q che con SKY, i cromosomi vengono classificati seguendo le linee guida dell'ISCN 2016: An International System for Human Cytogenomic Nomenclature

Il servizio di cariotipo Q-banding / spettrale SKY, include:
● Scongelamento e crescita delle cellule (sia umane che murine)
● Allestimento e valutazione della qualità delle metafasi
● Colorazione per Q-banding / Ibridazione per SKY
● Analisi di almeno 20 metafasi per ciascuna linea cellulare
● Almeno un'immagine di alta qualità di un cariotipo rappresentativo in formato conforme per pubblicazione
● Interpretazione completa dei risultati e consultazione interpretativa da parte di uno specialista
● Rapporto di analisi per ogni linea cellulare analizzata

 

Cariotipo molecolare - aCGH

Il cariotipo molecolare ad alta risoluzione basato su piattaforme array consente di rilevare anomalie e riarrangiamenti che verrebbero persi con le indagini cromosomiche tradizionali. Variazioni di numero di copie (CNV) o condizioni di perdita di eterozigosi (LOH) possono ad esempio essere caratterizzate utilizzando l'ibridazione comparativa del genoma basata su array (array-based Comparative Genomic Hybridization, aCGH), una metodica in grado di identificare anomalie genomiche submicroscopiche anche di poche migliaia di paia di basi e di definire esattamente la regione genomica alterata e i geni in essa contenuti.

L'intero servizio da colture cellulari vive o congelate comprende:

  • Scongelamento e crescita delle cellule in coltura
  • Estrazione e quantificazione del DNA genomico
  • Marcatura e ibridazione del DNA con piattaforma Agilent
  • Estrazione e analisi dei dati con il software Agilent Cytogenomics
  • Almeno un'immagine di alta qualità in un formato idoneo per pubblicazione
  • Interpretazione completa dei risultati e consultazione interpretativa da parte di uno specialista
  • Rapporto di analisi per ogni linea cellulare analizzata inclusiva dei dati grezzi

Riprogrammazione cellulare

La scoperta delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha rivoluzionato la ricerca basata sulla medicina personalizzata. Le iPSC sono una tipologia di cellule pluripotenti derivate in laboratorio da cellule altamente differenziate (tipicamente fibroblasti e PBMC) tramite l’introduzione di combinazioni di più fattori di pluripotenza. Questa tecnologia permette di ottenere cellule in uno stadio simil-embrionale in grado di intraprendere molteplici destini differenziativi senza l'utilizzo di materiali embrionali e quindi con ridotte problematiche di tipo etico.

Dal punto di vista applicativo, rappresentano una promettente fonte alternativa di cellule staminali paziente-specifiche con grandi potenzialità per sviluppi terapeutici nel campo della medicina rigenerativa. Inoltre, costituiscono un’ottima piattaforma sperimentale per lo studio di malattie umane (disease modeling), screening di nuovi farmaci (drug screening) e per studi di tossicologia.
Il processo per generare cellule iPS correttamente riprogrammate e controllate per la pluripotenza e la stabilità genomica richiede tempo e una vasta esperienza tecnica.

Generazione di hiPSC da cellule somatiche adulte

Offriamo il servizio di generazione di iPSC a partire da fibroblasti e PBMC prelevati da donatori sani o da pazienti, utilizzando sia vettori episomici che il virus Sendai per veicolare i fattori riprogrammanti all’interno delle cellule. Una volta generate, le iPSC vengono saggiate in termini di pluripotenza e capacità di differenziarsi nei tre foglietti embrionali (differenziazione trilineage) mediante l’analisi di espressione di specifici marcatori. Le cellule prodotte vengono inoltre controllate per stabilità genomica e per l’assenza di contaminazioni fungine/batteriche/micoplasma. 

Il servizio di riprogrammazione comprende:

  • Scongelamento e coltura cellulare della linea di partenza
  • Trasfezione/trasduzione di fattori riprogrammanti
  • Selezione, isolamento ed espansione delle singole colonie iPSC generate
  • Valutazione (morfologia, pluripotenza, differenziamento trilineage) ed espansione di 3 cloni iPS per ogni linea cellulare
  • Valutazione dell'assenza dei vettori di trasduzione
  • Analisi di sterilità per batteri e funghi in ogni clone prodotto
  • Analisi del micoplasma mediante PCR in ogni clone prodotto
  • Congelamento di almeno 5 provette criogeniche per clone (> 1x106 cellule/provetta)
  • Vitalità post-scongelamento di ciascun clone
  • Consegna o conservazione all’interno dell’area dedicata allo stoccaggio su richiesta

Differenziamento tessuto-specifico di hiPSCs

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno la capacità di moltiplicarsi indefinitamente e di differenziarsi in molteplici linee cellulari. Di conseguenza, costituiscono una fonte pressoché illimitata di diverse tipologie cellulari, incluse cellule difficili da isolare (come cardiomiociti, neuroni e megacariociti), per sviluppare modelli di studio altamente fisiologici e paziente-specifici. Gli operatori di bioKryo Italy hanno collaborato a numerosi studi su cellule staminali e iPSC e mettono a disposizione la loro esperienza per servizi personalizzabili di differenziamento delle iPSC in diversi tipi cellulari.

Differenziamento di iPSC in cardiomiociti

Eseguiamo, tramite un protocollo validato e robusto, il differenziamento di iPSC in cardiomiociti funzionali che possono essere utilizzati come modelli in vitro per studi elettrofisiologici, analisi biochimiche, sviluppo di nuovi farmaci, screening di tossicità e studi genetici. I cardiomiociti ottenuti in questo modo rappresentano una valida alternativa alle cellule staminali embrionali e ai modelli animali. Forniamo cardiomiociti derivati da iPSC derivanti da donatori sani o da individui con patologie.

L'intero servizio comprende:

  • Scongelamento, espansione e validazione delle iPSC
  • Differenziamento cardiomiocitico delle iPSC
  • Immagini a contrasto di fase delle linee iPSC parentali dopo l'espansione e dei cardiomiociti differenziati
  • Video dell’attività pulsante della coltura di cardiomiociti
  • Caratterizzazione di cellule differenziate mediante colorazione immunocitochimica con 3 marcatori specifici (cTNT, SMA, Nkx2.5)
  • Consegna di cardiomiociti funzionali e rapporto di analisi per ogni linea cellulare analizzata

Differenziamento di iPSC in megacariociti

I megacariociti (MK) sono cellule ematopoietiche altamente specializzate deputate alla produzione e al rilascio di piastrine, cellule che ricoprono un ruolo essenziale nei meccanismi di emostasi primaria e nella coagulazione sanguigna. Si tratta di cellule mieloidi che costituiscono solo circa l’1% della popolazione cellulare residente nel midollo osseo. La generazione ex vivo di MK da iPSC fornisce una fonte cellulare rinnovabile di piastrine che possono essere congelate e rese disponibili su richiesta senza dover fare affidamento su frequenti prelievi di sangue dei pazienti.
Eseguiamo, tramite un protocollo validato e robusto, il differenziamento di iPSC in magacariociti funzionali che possono essere utilizzati come modelli in vitro per saggi biochimici e farmacologici. Forniamo megacariociti derivati da iPSC derivanti da donatori sani o da individui con patologie.

L'intero servizio comprende:

  • Scongelamento, espansione e validazione delle iPSC
  • Differenziamento magacariocitico delle iPSC
  • Immagini a contrasto di fase delle linee parentali iPSC e dei MK dopo il differenziamento
  • Caratterizzazione di cellule differenziate mediante citofluorimetro a flusso per l’espressione dei marcatori di superficie tipici dei megacariociti CD41 e CD42b e del grado di ploidia
  • Consegna di megacariociti funzionali e rapporto di analisi per ogni linea cellulare

Differenziamento di hMSC

Differenziamento trilineage di hMSC
Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC), denominate anche cellule stromali multipotenti,
rappresentano un esempio di cellule staminali adulte. Oltre che dal midollo osseo, le hMSC possono essere isolate da un'ampia gamma di altri tessuti, come il tessuto adiposo, il sangue del cordone ombelicale, la placenta, la pelle e i follicoli piliferi. Possiedono un grande potenziale nella rigenerazione dei tessuti e nella terapia cellulare in quanto sono in grado di produrre diversi tipi di cellule specializzate tra cui adipociti, osteociti, condrociti, cellule epiteliali, cellule simili a neuroni e a epatociti. Oltre all’isolamento dai tessuti, l'utilizzo delle hMSC richiede la conferma del loro potenziale staminale cioè la verifica rigorosa della loro capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteoblasti quando coltivate in vitro (differenziamento trilineage).

L'intero servizio comprende:

  • Scongelamento ed espansione delle hMSC da tessuti di diversa origine
  • Monitoraggio della morfologia
  • Valutazione di differenziamento trilineage tramite colorazione con:
    ○ Alizarin Red che evidenzia la deposizione di calcio mineralizzato tipica del differenziamento osteogenico
    ○ Oil Red per identificare depositi di trigliceridi, i principali componenti dei depositi lipidici presenti negli adipociti
    ○ Alcian Blue per evidenziare la formazione di aggregati cartilaginei e l'accumulo di proteoglicani
  • Analisi dei livelli di espressione di specifici marcatori mediante qRT-PCR
  • Consegna di cellule differenziate funzionali e rapporto di analisi per ogni linea cellulare analizzata

Generazione di organoidi/sferoidi

Generazione e differenziamento tessuto-specifico di organoidi/sferoidi

Le colture cellulari sono strumenti indispensabili per la ricerca biologica di base, traslazionale e preclinica. Oltre al modello classico di coltura cellulare, che prevede la crescita in vitro delle cellule in monostrato (2D), sono stati introdotti sistemi di crescita cellulare in 3D che permettono la formazione di aggregati cellulari, i cosiddetti organoidi (o sferoidi). Tali strutture riproducono più fedelmente l’architettura di organi e tessuti umani rispetto ai monostrati cellulari e rappresentano quindi modelli promettenti per lo studio dei processi fisiologici. Inoltre, gli organoidi sono suscettibili di tutte le analisi cellulari/molecolari/farmacologiche già sviluppate per le linee cellulari tradizionali. Grazie alla stretta somiglianza con gli organi umani, il loro studio ha un grande potenziale per la ricerca traslazionale.

Eseguiamo la generazione di organoidi cerebrali umani da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) in grado di ricapitolare le caratteristiche dello sviluppo corticale umano.

L'intero servizio comprende:

  • Scongelamento, espansione e validazione delle iPSC
  • Differenziamento tessuto-specifico delle iPSC
  • Immagini a contrasto di fase delle linee iPSC dopo l'espansione e degli organoidi generati in diversi fasi di crescita
  • Caratterizzazione mediante immunofluorescenza con marcatori specifici
  • Consegna di organoidi funzionali
BioKryo Italy mette a disposizione per la comunità scientifica linee cellulari umane e animali. Tutte le linee cellulari sono state caratterizzate secondo specifiche SOP e vengono accompagnate da una scheda tecnica contenente tutte le informazioni su caratteristiche e  controllo di qualità effettuato.

Cellule staminali umane

BioKryo Italy mette a disposizione dei ricercatori una selezione di cellule staminali umane, tra cui hESC e hiPSC.

Cellule staminali animali

BioKryo Italy mette a disposizione dei ricercatori una selezione di linee cellulari animali.

Fibroblasti umani

BioKryo Italy mette a disposizione di ricercatori una selezione di fibroblasti primari.

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